Posláním Národního muzea je přispívat k rozvíjení národní identity, stejně jako vědomí příslušnosti k širšímu celku evropského a světového společenství a kultury. Je polytematickým ústavem, který zahrnuje řadu vědních oborů a sběrných oblastí od přírodních věd až po specializované obory věd společenských. Tvoří jej pět odborných složek (Přírodovědecké muzeum, Historické muzeum, Knihovna Národního muzea, Náprstkovo muzeum asijských, afrických a amerických kultur – součást Národního muzea od roku 1932, Muzeum české hudby – součást Národního muzea od roku 1984), pět odborů (Odbor ekonomického náměstka, Odbor provozního náměstka, Odbor náměstka pro centrální sbírkotvornou a výstavní činnost, Odbor náměstka pro investiční rozvoj, Odbor digitalizace a informačních systémů) a Ředitelství.

Národní muzeum shromažďuje sbírky hmotných dokladů vývoje přírody, prehistorie a historie české i zahraniční provenience, zejména v oborech mineralogie, geologie, petrologie, paleontologie, hydrobiologie, mykologie, botaniky, entomologie, zoologie, antropologie, prehistorie a protohistorie, středověké archeologie, klasické archeologie, českých dějin, národopisu, numismatiky vč. mimoevropské, dějin divadla, dějin tělesné výchovy a sportu, pravěku a starověku Předního východu a Afriky, mimoevropské etnografie, asijské kultury, muzikologie a knihovědy. Sbírky tvoří na základě vědeckého poznání a vlastní koncepce sbírkotvorné činnosti.

Mezi hlavní role, které Národní muzeum plní, patří: 

  • Shromažďování a správa sbírkových předmětů, odborné dokumentace a poznatků získaných jejich odborným zpracováním a vědeckým zhodnocením a prezentace zejména prostřednictvím stálých expozic a krátkodobých výstav, vlastní publikační a přednáškovou činností v České republice i v zahraničí.
  • Správa historického knižního fondu, zámeckých knihoven, odborné veřejné knihovny a specializovaného archivu.
  • Pořádání kulturních a vzdělávacích programů vyplývajících z předmětu činnosti.
  • Vydávání a šíření periodických i neperiodických publikací, audio a videonahrávek.
  • Pedagogická činnost v rámci svého zaměření.
  • Vydávání osvědčení k vývozu předmětů kulturní hodnoty podle zákona č. 71/1994 Sb. o prodeji a vývozu předmětů kulturní hodnoty.
  • Zpracovávání odborných posudků, rešerší a expertíz.