Přestože byl sběr hudebních nástrojů od doby založení Národního muzea až do vzniku samostatného hudebního oddělení v roce 1946 nahodilý, podařilo se v tomto období získat velmi cenné hudební nástroje. Jedním z prvních přírůstků je unikátní soubor renesančních dechových nástrojů, tzv. Rožmberská kapela. Do muzea se dostaly v tomto období rozsáhlé soubory hudebních nástrojů darované muzeu českými nástrojaři či sběrateli (Ondřej Horník, Antonín Buchtel, Karel Boromejský Dvořák, Josef Šediva, Jan Pohl a další). Cenné nástroje byly také získány po 2. světové válce jako konfiskáty na základě Benešových dekretů a pak ze zrušených klášterů.

Sbírka, která má dnes kolem 3000 hudebních nástrojů, obsahuje jak evropské, tak světové unikáty – patří k nim špičkové strunné smyčcové nástroje (např. housle z dílny Giuseppe Garneriho del Gesù či rodiny Stradivari), klávesové nástroje (tzv. Mozartův klavír, Hábův čtvrttónový klavír) či dechové nástroje (tzv. Rožmberská kapela), sbírka mapuje i pozoruhodný a bohatý vývoj české nástrojařské školy a další pozoruhodné české fenomény (pražská houslařská škola, krkonošská houslařská škola, Václav František Červený, Josef Šediva, české háčkové harfy, mikrointervalové nástroje, hudební automatofony apod.). Aktuální sbírkotvorná činnost se zaměřuje na doplňování a další formování sbírek a také na zaplňování „bílých míst“ v historii českého nástrojařského řemesla či české hudební kultury obecně.