Sbírka rukopisů a starých tisků Knihovny Národního muzea byla od počátku budována s ohledem na bohemikální koncepci, kterou formuloval v roce 1823 Josef Dobrovský. Později se součástí akvizice stávaly rovněž doklady o zahraničních rukopisných a typografických památkách. Za její základ byly položeny dary českých šlechtických rodů (Sternbergové, Kolowratové, Pálffyové, Klebelsbergové ad.).

Rukopisná sbírka pokrývá svým fondem čítajícím cca 6 000 svazků období dějin od 10. do 20. st. Obsahuje jednak vlastní sbírku rukopisných knih (signatury I-XVIII), jednak sbírku rukopisných zlomků (signatury 1–2). K nejvýznamnějším rukopisným památkám bezpochyby patří iluminované kodexy Liber viaticus Jana ze Středy, Mater verborum, Jenský kodex, Budyšínský rukopis a falza Rukopis královédvorský a zelenohorský.

Sbírka starých tisků (signatury 1–2, 10–74, 101–102) čítající cca 25 000 svazků zahrnuje období od počátku knihtisku v polovině 15. století až do roku 1800 včetně, s určitými přesahy do 19. století. K typografickým unikátům sbírky oddělení rukopisů a starých tisků patří český prvotisk Kronika trojánská Guidona de Columna, 48řádková bible Gutenbergových nástupců Johanna Fusta a Petera Schöffera, sbírka letáků z třicetileté války, tzv. Troilův sborník a rozsáhlá sbírka produkce bratrské tiskárny v Ivančicích, Kralicích a posléze v polském Lešně.

Součástí sbírek oddělení rukopisů a starých tisků jsou také samostatné knihovní fondy, jež vznikly sběratelskou činností soukromých osob, rodů a institucí. Knihovna významného sběratele Bohuslava Duška (signatura Dušek), souborný fond knihovny Jaroměřského zubaře a bibliofila Jana Loužila a jeho syna Jaromíra, znalce a editora díla Bernarda Bolzana (signatura Loužil) a knižní soubor z pozůstalosti českého literárního vědce Antonína Škarky (signatura Škarka). K rozsáhlejším sbírkám patří knihovna Eduarda Langera, dědice Schrollových severočeských textilních závodů, pozoruhodná především souborem vzácných prvotisků (signatura Langer).  Obsahově teologicky zaměřené jsou knihovny českého piaristy, učence a kritického historiografa Gelasia Dobnera (signatura Dobner), knihovní fond jezuitské koleje svatého Ignáce na pražském Karlově náměstí (signatura Ignác) a historicky cenná klášterní knihovna roudnických kapucínů (signatura Kap.).

Ve správě oddělení jsou rovněž dvě poslední pražské palácové interiérové knihovny: Majorátní knihovna hrabat z Nostic a Rienecka na malostranském Maltézském náměstí (signatura Nostic – cca 14 000 svazků) a Knihovna knížat Kinských na Staroměstském náměstí (signatura Kinských – cca 34 000 svazků). Součástí obou palácových knihoven jsou od 50. let minulého století rovněž menší a mladší knižní sbírky uložené původně na nostickém zámku v Měšicích (signatura Měšice – cca 2 000 svazků) a na zámku rodu Kinských v Heřmanově Městci (signatura Heřmanův Městec – cca 900 svazků).

Katalogy a databáze:

Soupis rukopisů F. M. Bartoše je součástí databáze Manuscriptorium, kde je možno prohlížet celé naskenované rukopisy ze sbírek Knihovny Národního muzea. Iluminované rukopisy jsou podrobně popsány v Katalogu Pavla Brodského z roku 2000. V roce 2001 byl vydán Katalog prvotisků Knihovny Národního muzea a zámeckých a hradních knihoven v České republice autorů Jaroslava Vrchotky a Jitky Šimákové. Staré tisky jsou dostupné v online katalogu oddělení rukopisů a starých tisků.