Základ podsbírky byl položen na začátku 20. století, kdy Národní muzeum získalo první a zároveň rozsáhlé sbírky motýlů od Františka Antonína Nickerla a jeho syna Otakara Nickerla staršího, Napoleona Manuela Kheila a později od dalších významných entomologů, zejména Arnošta Silbernagela a Otto Holika. Postupně pak přibývaly do sbírkového fondu desítky menších či větších sbírek motýlů, posledními velkými přírůstky jsou vědecky cenné sbírky Bohumila Vančury a Kristiána Kruška.

Podsbírka motýlů je v současnosti aranžována na třech základních úrovních.

  • (1) Menší část sbírkového materiálu je systematicky roztříděna (dnes označena jako základní sbírka – ZS) a uložena ve starších entomologických krabicích o rozměrech 40x50x6 cm. Krabice jsou opatřeny plným víkem, přičemž pod ním je ještě skleněný záklop. Uspořádání taxonomické sbírky, úroveň determinací a formální náležitosti (např. úroveň jmenovek jednotlivých druhů v krabicích, označení krabic apod.) odpovídá době, ve které byla ZS zakládána, tedy přibližně 50. letům minulého století. V pozdějších letech byla ZS, respektive pouze některé skupiny, částečně doplňována novějším materiálem, nicméně v celkovém objemu se nejednalo o zásadní aktivity. Z hlediska jednotlivých skupin byla největší pozornost věnována tzv. denním motýlům Palearktické oblasti. Ostatní skupiny tzv. velkých nočních motýlů byly systematicky uspořádány pouze částečně, některé vůbec. Zcela nezpracovaní (s výjimkou několika malých čeledí) zůstaly až do současnosti tzv. drobní motýli.
  • (2) Na druhé úrovni se v současnosti nachází početně zřejmě největší část sbírkového materiálu. Jedná se o samostatné sbírky, které jsou uloženy v původním stavu a zatím nebyly roztříděny do ZS z důvodu nedostatečných prostor na předchozím pracovišti EO. Sbírkový materiál je uložen v původních krabicích, z velké části nestandardních rozměrů a taktéž úroveň uspořádání a korektnost determinací odpovídá odborné úrovni a osobní pečlivosti původních majitelů sbírek.
  • (3) Třetí úrovní je zcela nesetříděný materiál. Převážně se jedná o druhy tropických motýlů (z části bez lokalitních štítků), které byly kdysi vyjmuty z historických sbírek a velmi orientačně soustředěny do dvou skupin: s denní a noční aktivitou imág. Toto uspořádání bylo tehdy prvním krokem k budoucímu systematickému aranžování, bohužel k dalším krokům již nedošlo. Až od roku 2015 byly započaty intenzivní práce s tímto materiálem, přičemž v tuto chvíli se již část sbírkového fondu dočkala svého konečného umístění v ZS. Vedle těchto třech úrovní je třeba zmínit poměrně početný studijní materiál, který průběžně přibývá vlastními aktivitami pracovníků EO například v rámci pracovních cest. Tento materiál je však průběžně determinován a taxonomicky aranžován, čímž se průběžně dostává na úroveň 2.

Celkově podsbírka motýlů zahrnuje přibližně milion vypreparovaných jedinců, kteří jsou uloženi v cca sedmi tisících krabicích. Kromě faunisticky cenných dokladů (především druhů vyhynulých na svých tradičních lokalitách) obsahuje podsbírka motýlů i několik set typových exemplářů, a to napříč téměř všemi skupinami. Za zvlášť cenné je možné zmínit uložení početného typového materiálu vřetenušek popsaných Otto Holikem v polovině 20. století a několik desítek typů můr, které nashromáždil za svého života Kristián Krušek.